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Un approccio pratico alla Globulo rosso Analisi Folato Dipartimento di Nutrizione Scienze, University of Alabama a Birmingham, AL 35294 Corrispondenza: Chandrika J Piyathilake, Dipartimento di Nutrizione Scienze, Divisione di nutrizionale Biochimica e Biologia Molecolare, Università di Alabama a Birmingham (UAB) 1675 University Blvd, Webb 318A, Birmingham, AL 35294. Tel: 205-975-5398; Fax: 205-966-2859; E-mail: ude. bau@cihtayip Copyright & # x000a9; 2007 Gli autori. Questo articolo è un articolo ad accesso aperto distribuito secondo i termini e le condizioni della licenza Creative Commons Attribution (http://creativecommons. org/licenses/by/3.0/). Questo articolo è stato citato da altri articoli in PMC. astratto La misura di folati nei globuli rossi (RBC) è preferito poiché riflette lo stato dei folati a lungo termine nel corpo rispetto al plasma / folati nel siero che può essere influenzato dalla recente assunzione con la dieta. La tecnica comunemente accettata per RBC analisi folato prevede la preparazione di un emolisato utilizzando un campione di sangue intero fresco. le concentrazioni di ematocrito e di folato plasmatico sono necessari per calcolare i valori di folati RBC. A causa della necessità di un accesso immediato a un laboratorio dove lavorazione può essere eseguita, può non essere pratico per valutare lo stato dei folati RBC utilizzando questo metodo in studi epidemiologici campo-basati. Tuttavia, è possibile isolare imballato SRB da un campione di sangue in queste condizioni. Lo scopo di questo studio è quello di validare RBC analisi folati con globuli rossi concentrati confrontando i valori di folati RBC ottenuti con il metodo di emolisato (test di routine) con quelli ottenuti utilizzando globuli rossi confezionati (nuovo Assay) negli stessi individui (n = 50) con il test microbiologico folati. La correlazione tra folato plasma e il test di routine folato RBC (r = 0,58, p = 0,001) e la correlazione tra folato plasma e il nuovo test RBC folato era statisticamente significativa (r = 0,55, p = 0,001). La correlazione tra RBC folato con il test test e nuova routine è stato anche statisticamente significativa (r = 0.78, p & # x0003c; 0.001). Concludiamo che la misurazione di folato nel imballato RBC è un approccio pratico per valutare lo stato dei folati a lungo termine nel campo-based e o studi epidemiologici su scala più grande, dove un accesso immediato a un laboratorio non è disponibile per l'elaborazione del campione necessari per il test di routine folato RBC. Parole chiave: acido folico, imballato RBC, Emolisato introduzione Di circolazione analisi folati nel sangue è stato il test diagnostico di routine per la carenza di folati per oltre tre decenni. Valutazione dello stato di folati è stato anche importante a causa del suo ruolo nel ridurre il rischio di malattie cardiovascolari [1], difetti del tubo neurale [2] e tumori [3]. La misura di folati nei globuli rossi (RBC) è preferito poiché riflette lo stato dei folati a lungo termine nel corpo rispetto al plasma / folati nel siero che può essere influenzato dalla recente assunzione con la dieta [4]. La tecnica comunemente accettata per RBC analisi folati prevede la preparazione di un emolisato utilizzando sangue intero fresco diluendo in appena preparato 1% di acido ascorbico. L'incubazione del emolisato a 37 & # x000ba; C per 20 minuti consente coniugasi plasma endogena (gamma-glutamil carbossipeptidasi) per convertire RBC poliglutammati folati a folati assayable. A causa della necessità di un accesso immediato a un laboratorio dove emolisati possono essere preparati adeguatamente, può non essere pratico per valutare lo stato RBC folato in studi epidemiologici campo-basati. Tuttavia, è possibile isolare globuli rossi concentrati da un campione di sangue in queste condizioni. Lo scopo di questo studio è quello di validare RBC analisi folati con globuli rossi concentrati confrontando i valori di folati RBC ottenuti con il metodo di emolisato con quelli ottenuti utilizzando eritrociti concentrati negli stessi individui. Materiali e metodi Abbiamo utilizzato 50 campioni scelti a caso che sono stati trattati e conservati da un ampio studio in cui tutti i partecipanti allo studio hanno dato il permesso di usare i loro campioni in studi futuri relativi alla ricerca sul cancro. Questi campioni sono stati raccolti su un periodo di 12 mesi. Tutti i campioni sono stati immediatamente trattati e immagazzinati opportunamente valutare plasma e RBC folato utilizzando un metodo Emolisato RBC. Brevemente, un campione di 10 ml di sangue è stato raccolto in un EDTA (viola top) tubo vacutainer. L'ematocrito (necessario per calcolare le concentrazioni di folati RBC) è stata misurata utilizzando 25 & # x003bc; l di sangue intero. Dopo la miscelazione 25 e # x003bc; l di sangue intero con 725 e # x003bc; l di preparati 1% ascorbato per il dosaggio folato RBC, i resti dei campioni di sangue intero sono stati centrifugati a 3000 rpm per 10 minuti per separare il plasma da globuli rossi . Plasma stata trasferita in un tubo separato e conservato a & # x02212; 80 & # x000ba; C fino all'uso per l'analisi folato. buffy coat è stato tolto con cura per rimuovere tutte le cellule bianche del sangue dal campione. I globuli rossi concentrati sono stati trasferiti in una provetta da centrifuga e conservati a & # x02212; 80 & # x000ba; C fino al momento per le analisi future. In questo studio, abbiamo utilizzato il plasma, globuli rossi e globuli rossi emolisato confezionati per l'analisi dei folati dagli individui selezionati. Preparazione di globuli rossi per l'analisi folato Quando i campioni di sangue fresco raccolti sono stati utilizzati per il saggio di folati RBC, la conversione di RBC poliglutammati folati a monoglutamates è stato raggiunto enzimaticamente da folato plasmatico coniugasi dopo l'incubazione del emolisato (preparato miscelando 25 & # x003bc; l di sangue intero con 725 & # x003bc; l di acido ascorbico 1% preparata di fresco) a 37 e # x000ba; C per 20 minuti. plasma di ratto è stato usato come fonte di coniugasi per convertire poliglutammati folati a monoglutamates nei globuli rossi confezionati. plasma di ratto (Harland Bio, prodotti per la scienza, Catalog # BT-4511) è stato trattato con carbone attivo (Sigma, Catalog # C-4386)) per rimuovere folati; 750 mg di carbone per 15 ml di plasma di ratto venne agitata delicatamente per 60 minuti su ghiaccio e centrifugati a 3500 rpm a 4 e # x000b0; C per 5 minuti. Il surnatante è stato filtrato attraverso un filtro da 0,22 micron. Dopo che il plasma di ratto è stato testato per il folato per assicurarsi che sia libero di folato, aliquote sono state fatte e conservati a & # x02212; 70 & # x000b0; C. esperimenti iniziali hanno indicato che la conversione ottimale poliglutammati folato in campioni RBC può essere ottenuto miscelando 25 & # x003bc; l di eritrociti concentrati con 712,5 e # x003bc; l di preparati di acido ascorbico 1% e 12,5 & # x003bc; l di plasma di ratto (carbonella nuda) e incubando la miscela a 37 & # x000ba; C per 30 minuti. Tutti i campioni di cellule rossi concentrati sono stati preparati seguendo questo protocollo. L. casei microbiologica Assay L'adattamento piastra a 96 pozzetti di L. casei test microbiologico è stato utilizzato per misurare i livelli di folati totali nei campioni trattati in modo appropriato di RBC e del plasma [5, 6, 7]. Brevemente, 20 e # x003bc; l di campione e dello standard folato (15 ng / ml) è stato utilizzato nel saggio. I volumi del campione e dello standard sono stati regolati a 300 & # x003bc; l utilizzando tampone fosfato 0,1 M (pH 8,6) contenente 10 mg / ml di acido ascorbico. Sei diluizioni seriali dei campioni e degli standard (standard folato nell'intervallo da 0,005 a 0,15 ng / 0,3 ml dosaggio bene dopo diluizioni seriali) sono state effettuate utilizzando un pipettatore 12 canali. Poi 150 & # x003bc; l di terreno L. casei contenente L. casei, ad una concentrazione di 5 & # x003bc; l / 10 ml di terreno) è stato pipettato in tutti i pozzetti e incubato per 18 ore a 37 & # x000ba; C . Dopo l'incubazione, il contenuto di ogni pozzetto sono state sospese con ripetuta aspirazione e lavaggio più volte con un pipetter 12 canali. La crescita batterica è stata misurata mediante lettura della densità ottica a 655 nm. Questo test si basa sulla capacità del folato nel campione per stimolare Lactobacillus casei (ATTC 7469) crescita relativa agli standard folato contenenti. Il coefficiente di variazione e il recupero di questo test sono 5% & # x02013; il 7% e il 96% & # x02013; 105% rispettivamente. Per monitorare la riproducibilità di questi saggi, due campioni compositi (alto e basso) preparati da plasma ottenuto dalla Croce Rossa Americana è stato analizzato almeno 30 volte ed i mezzi e le deviazioni standard sono stati determinati. Queste servito come base per il controllo della qualità dei dosaggi (i test di campioni di studio sono state ripetute se i valori dei campioni di controllo in ciascun test erano oltre due deviazioni standard dalla media). Le piscine basse e alte stati inclusi in ogni piatto. Plasma, RBC Emolisato e preparazioni RBC confezionati dagli stessi individui sono stati saggiati per il folato nelle stesse condizioni sperimentali (stessa lastra, stesso giorno, ecc). Calcolo del RBC folato La seguente formula è stata usata per calcolare RBC folato quando è stato utilizzato il test di routine. Whole & # x02009; Blood & # x02009; folati & # x02009; (Ng / ml) e # x02212; [Plasma & # x02009; folati & # x02009; ng / ml (1 e # x02212; ematocrito / 100)] ematocrito / 100 Questa formula effettua una correzione per folato plasmatico presente in tutto emolisato di sangue e per la proporzione di sangue che consiste di RBC. Poiché globuli rossi sono utilizzati nel nuovo test, una correzione per il folato plasma o dell'ematocrito non è necessaria nel nuovo saggio. Il plasma di ratto utilizzato in questo test è stato messo a nudo il carbone ed è stato testato per non avere folato rilevabile. Inoltre, l'esperimento descritto di seguito è stato eseguito per valutare se l'efficienza coniugasi ratto plasma è diversa da quella della coniugasi plasma umano. Per condurre questo esperimento, i campioni di sangue prelevati da sei individui sono stati centrifugati a 3000 rpm / 10 minuti. Il mantello di plasma e Buffy sono stati rimossi per isolare RBC. Due aliquote di RBC di ciascun campione sono state trattate con plasma di ratto o plasma umano da ogni individuo come descritto in precedenza. Un ulteriore esperimento è stato condotto anche per determinare se la rimozione di buffy coat fa la differenza nei valori di folato RBC. I campioni di sangue provenienti da sei persone tratte in tubi duplicati (5 ml ciascuno) sono stati utilizzati in questi esperimenti. Tutti i tubi sono stati centrifugati a 3000 rpm / 10 minuti. Plasma è stato rimosso da un tubo di ogni individuo lasciando buffy coat e globuli rossi concentrati. Dall'altra serie di tubi, cappotto al plasma e Buffy è stato rimosso lasciando solo i globuli rossi concentrati. RBC con o senza buffy coat è stato trattato con plasma di ratto come descritto in precedenza. Analisi statistica statistiche descrittive come la media, mediana, deviazione standard (SD) della media, e la gamma sono stati calcolati per esaminare le differenze tra il metodo emolisato RBC (di routine) e il metodo di ematocrito RBC (nuovo). Wilcoxon Test per ranghi è stato impiegato per determinare la significatività statistica delle differenze tra risultati folato ottenuti mediante le tecniche di routine e nuovi. Le differenze tra i valori di folato dovute all'uso di plasma di ratto o plasma umano o le differenze nei valori folato causa di rimozione o di lasciare il buffy coat stati testati con test statistici simili. Non parametrico (Spearman) correlazione analisi sono stati impiegati per determinare l'associazione tra folato risultati delle tecniche di routine e nuovi risultati La media & # x000b1; SD e mediano di RBC folato con il test di routine era 449 & # x000b1; 216 ng / ml e 399 ng / ml. La media & # x000b1; SD e mediano di RBC folato dal nuovo test è stato 366 & # x000b1; 188 ng / ml e 309 ng / ml. La differenza tra i due test è risultata statisticamente significativa (p & # x0003c; 0,001, Wilcoxon Rank Test). In 43 campioni, i valori di folato RBC erano più alti con il test di routine rispetto al nuovo test e 7 campioni avevano valori elevati di folato RBC con il nuovo test rispetto al test di routine. Nel complesso, con 43 campioni, i valori di folato RBC erano inferiori al 23% con il nuovo test rispetto al test di routine. Con 7 campioni, valori di folato RBC erano più alti del 10% con il nuovo test rispetto al test di routine. I valori di RBC superiori o inferiori per la nuova tecnica rispetto alla tecnica di routine sono stati distribuiti in modo non uniforme nel set di dati. Non c'era alcuna associazione inversa tra le lunghezze di conservazione dei campioni oltre i 12 mesi i valori di folati per indicare che il tempo di conservazione più lunghi possono dare valori di folati RBC più bassi dalla nuova tecnica. La correlazione tra folato plasma e il test di routine folato RBC (r = 0,58, p = 0,001) e la correlazione tra folato plasma e il nuovo test RBC folato era statisticamente significativa (r = 0,55, p = 0,001). La correlazione tra RBC folato con il test test e nuova routine è stato anche statisticamente significativa (r = 0.78, p & # x0003c; 0.001, Figura 1). Correlazione tra RBC folato misurate con il test di routine e il nuovo saggio. In media, i valori folato nei globuli rossi di campioni trattati con plasma di ratto sono stati inferiori del 24% rispetto ai valori RBC di campioni trattati con plasma umano e questa differenza era statisticamente significativa (p = 0,03). I valori di folati nei globuli rossi di campioni con buffy coat avevano valori di folati leggermente superiori rispetto ai campioni RBC senza buffy coat, ma la differenza tra i due non era statisticamente significativa (p = 0,27). Discussione I valori di folato possono essere misurati utilizzando un / folato plasmatico siero o un saggio di folato globuli rossi. Un saldo negativo folati visto in pazienti ricoverati in ospedale sono mostrati tradursi in un valore di folati sierici basso senza deficit di folati [8]. Pertanto, a basso folati globuli rossi, pensato per indicare la carenza di tessuti, può essere più importante di un basso folati sierici nella diagnosi di carenza di folati. Più lungo termine lo stato dei folati è anche probabile che sia più informativo nel valutare la sua importanza nelle malattie croniche come le condizioni cancerose cancerose o pre. Abbiamo recentemente riportato che una misura combinata di RBC e folati nel plasma di stato è un fattore predittivo molto più forte per la storia naturale (acquisizione, la persistenza o la clearance di alto rischio virus del papilloma umano, il principale fattore di rischio per CIN e cancro del collo dell'utero rispetto al solo folato plasmatico [9 ]. Queste osservazioni suggeriscono che la valutazione di RBC stato folato è importante negli studi epidemiologici campo-basati. Tuttavia, la necessità di un accesso immediato a un laboratorio dove ematocrito può essere misurata e emolisati possono essere preparati adeguatamente è un ostacolo utilizzando la routine folato RBC dosaggio in studi epidemiologici campo-basati. per questo motivo, i campioni non sono disponibili per valutare RBC stato folato biorepositories più attualmente disponibili degli studi epidemiologici Inoltre, la routine di calcolo folato RBC richiede che il valore per il folato plasma che aumenta il costo per la valutazione folato RBC in studi più grande scala. RBC valutazione folato utilizzando imballato RBC descritto in questo manoscritto elimina alcune di queste limitazioni. Documentiamo anche che globuli rossi possono essere memorizzati con o senza buffy coat e folato è stabile in questi campioni per un periodo di 12 mesi. Abbiamo notato che le concentrazioni di folato di RBC in un dato campione è probabile che sia inferiore quando plasma di ratto è stato utilizzato per convertire RBC poliglutammati folati a monoglutamates rispetto al plasma umano e questo può essere dovuto a una minore efficienza di plasma di ratto nella conversione poliglutammati RBC umani monoglutamates. Ciò non dovrebbe tuttavia interferire con l'interpretazione dei dati finché plasma di ratto viene utilizzato con tutti i campioni in un dato studio. Abbiamo usato questo test folati RBC di nuova concezione in un ampio studio epidemiologico in cui abbiamo confermato che il rapporto tra un polimorfismo nelle concentrazioni pathway e folati folati sono simili quando folati è stata misurata utilizzando il nuovo test e il test folati di routine che ha usato un sangue intero emolisato [10]. In conclusione, documentiamo che la misurazione di folato nel imballato RBC è un approccio pratico per valutare lo stato dei folati a lungo termine in ambito-based e o studi epidemiologici su scala più grande. Ringraziamenti Sostenuto in parte da R01 CA105448-01 dal National Cancer Institute. Riferimenti [1] Boushey C, Beresford S, G Omenn, Motulsky AG. Una valutazione quantitativa di omocisteina plasmatica come un fattore di rischio per malattia vascolare benefici probabili di aumentare l'assunzione di acido folico. JAMA. 1995; 274: 1049-1057. [PubMed] [2] Centri per il controllo delle malattie per Raccomandazioni l'uso di acido folico per ridurre il numero di casi di spina bifida e di altri difetti del tubo neurale. MMWR. 1992; 41 (RR-14): 1-7. [PubMed] [3] Mason JB, Levesque T. folato: effetti sulla cancerogenesi e il potenziale per la prevenzione del cancro. Oncologia. 1996; 10: 1727-1743. [PubMed] [4] Chanarin I. Le anemie megaloblastica. 3 ° Edn. 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Le interazioni tra due mutazioni comuni C677T e A1298C in gene reduttasi metilentetraidrofolato e le misure del metabolismo del folato e la stabilità del DNA (rotture dei filamenti, uracile misincorporated e DNA stato di metilazione) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004; 13 (9): 1436-1443. [PubMed] Articoli da Analytical Chemistry Approfondimenti sono forniti qui per gentile concessione di Libertas Academica
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